靈芝（Ganoderma lucidum）是一種屬于擔(dān)子菌門多孔菌科的藥用真菌，是一種具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和延年益壽作用的珍貴中藥材。靈芝的活性成分主要包括靈芝多糖（GLP）、蛋白質(zhì)、三萜類和麥角甾醇。G. lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst、Ganoderma japonium和鹿角靈芝（Ganoderma amboinense）是三種最常見的靈芝，先前的研究表明，GLP和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分。從靈芝孢子粉中純化的GLP由葡萄糖和半乳糖組成，50～400 μg/mL的GLP可以促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。研究人員觀察到，GLP的分子量分布為80～200 kDa。有研究用靈芝多糖給小鼠灌胃，觀察到靈芝多糖可以提高小鼠的免疫能力，并有較強的抗氧化作用。此外，有報道研究了GLP對A549肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，觀察到順鉑聯(lián)合GLP對A549細(xì)胞增殖有較強的抑制作用。 

到目前為止，關(guān)于靈芝子實體和孢子粉多糖的免疫增強活性、抗氧化活性、抗腫瘤活性和細(xì)胞保護(hù)作用的研究已經(jīng)非常深入，但關(guān)于靈芝菌絲體多糖（GAMPS）及其對細(xì)胞的保護(hù)作用以及傷口愈合作用的研究卻鮮有報道。通過深層液體發(fā)酵生產(chǎn)的靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖具有產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)點。山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所的Shuangzhi Zhao、Jinyu Yang、Leilei Chen等在本研究以液體發(fā)酵獲得的GAMPS為基礎(chǔ)，分析了GAMPS的單糖組成和分子量分布，同時分析了其生物活性，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞傷口愈合效果和抗氧化活性。具體來說，通過高效液相色譜法（HPLC）和高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）分別對GAMPS進(jìn)行了高效提取，并分析了其單糖組成和分子量分布。此外，在細(xì)胞水平上研究了其促進(jìn)THP-1細(xì)胞增殖的能力和對NIH/3T3細(xì)胞的劃痕損傷修復(fù)能力。最后，通過研究GAMPS的氧自由基吸收能力（ORAC），探討了其促進(jìn)正常細(xì)胞增殖和修復(fù)細(xì)胞損傷的機制。該研究為GAMPS的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。

結(jié)論和討論

GAMPS的單糖組成

酸解后的PMP衍生物通過HPLC檢測，得到GAMPS的單糖組成和摩爾百分比。如表1所示，GAMPS主要由Glc、Man和Gal組成，摩爾比為67.62∶14.07∶7.50，這與之前報道的GLP的單糖組成不同。由于靈芝的種類不同，它們在單糖組成和其他理化性質(zhì)上的差異可能與它們的特定功能密切相關(guān)。因此，對GAMPS的深入研究具有重要意義。 

表1  GAMPS的糖基組成

GAMPS的分子量分布

分子量是多糖的一個重要理化指標(biāo)，不同多糖來源的多糖分子量分布通常不同。通過HPGPC-滲透色譜-多角度激光散射（HPGPC-MALS）分析來確定GAMPS的分子量分布。如圖1所示，盡管在微分光譜上形成了多個吸收峰，但GAMPS的分子量分布卻集中在激光散射光譜的兩個峰上。此外，表2中列出了重量平均相對分子量（Mw）和數(shù)量平均相對分子量（Mn）。GAMPS的Mw分布為5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol，表明GAMPS大多以高分子量的多糖存在。峰1的累積分布為13.8%，峰2為80.7%。 

圖1  GAMPS的HPGPC-MALS結(jié)果 

表2  GAMPS的分子量

GAMPS對正常細(xì)胞的增殖能力

水溶性GLP的活性在一定程度上與分子量分布相關(guān)。高分子量的GLP通常具有更多的生物活性。一般來說，活性GLP的分子量大于1.0×10⁴ g/mol，否則，活性很低甚至沒有活性。在本研究中，通過水提取和醇沉法得到的GAMPS為高分子量多糖，分子量分別為5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol，這為GAMPS的促進(jìn)細(xì)胞增殖活性提供了可能。為了評估GAMPS對正常細(xì)胞的增殖活性，用一系列濃度梯度的多糖溶液處理4種正常細(xì)胞（293 T/17、HUv-EC-C、NIH/3T3和THP-1）。如圖2所示，0.02～0.2 μg/μL的GAMPS可以明顯促進(jìn)這4個細(xì)胞的增殖。在GAMPS濃度為0.1 μg/μL時，對NIH/3T3的增殖能力最強，細(xì)胞存活率為141.0%。在0.2 μg/μL的濃度下，對HUV-EC-C、THP-1和293 T/17的增殖能力最強，細(xì)胞存活率分別為144.9%、178.7%和157.8%。隨著GAMPS濃度的增加，HUV-EC-C、THP-1和293 T/17的存活率明顯增加，其中對THP-1的生長促進(jìn)作用最好。這些結(jié)果表明，GAMPS對正常細(xì)胞具有增殖能力。 

A. NIH/3T3；B. HUV-EC-C；C. THP-1；D. 293 T/17。

圖2  GAMPS處理正常細(xì)胞的存活率分析 

GAMPS對NIH/3T3的傷口愈合能力

為了研究GAMPS是否能促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的遷移，采用傷口愈合實驗來探討GAMPS（0.1 μg/μL）對NIH/3T3細(xì)胞劃傷后遷移的影響。如圖3所示，在無血清培養(yǎng)基中，NIH/3T3細(xì)胞受傷后開始遷移。當(dāng)加入低濃度的GAMPS（0.1 μg/μL）后，24 h后缺口基本愈合；而PBS對照組的細(xì)胞在48 h后仍未過度生長。因此，低濃度的GAMPS（0.1 μg/μL）對促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的遷移和修復(fù)劃痕損傷有作用。 

圖3  GAMPS對成纖維細(xì)胞NIH/3T3的損傷修復(fù)作用

GAMPS的ORAC

為了評價GAMPS的ORAC，以PBS緩沖液為空白對照，Trolox為陽性對照，檢測不同濃度GAMPS的熒光強度，并記錄熒光衰減情況。計算不同濃度的GAMPS和Trolox的ORAC熒光淬滅曲線的積分面積AUC，得到GAMPS的ORAC的Trolox當(dāng)量。如表3所示，GAMPS可以抑制自由基引起的熒光變化，且抑制能力隨GAMPS濃度的增加而增強，說明GAMPS具有較強的ORAC。 

表3  GAMPS的ORAC

結(jié)論

在本研究中，采用深層液體發(fā)酵法獲得靈芝菌絲體，采用水提取和醇沉法制備了GAMPS。經(jīng)檢測，GAMPS的分子量為5.439×10⁶ g/mol和1.704×10⁵ g/mol。此外，GAMPS由Glc、Man和Gal組成，摩爾比為67.62∶14.07∶7.50。濃度為0.02～0.2 μg/μL的GAMPS可以促進(jìn)4種正常細(xì)胞的增殖，包括NIH/3T3、HUV-EC-C、THP-1和293 T/17。同時，0.1 μg/μL的GAMPS對成纖維細(xì)胞NIH/3T3顯示出較高的傷口愈合活性。GAMPS的ORAC表明，它具有很強的抗氧化活性。該研究為GAMPS的開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

The normal cell proliferation and wound healing effect of polysaccharides from Ganoderma amboinense

Shuangzhi Zhao^a,b, Ming Lei^c, Hui Xu^a, Hailun He^c, Alexander Suvorov^a, Junhua Wang^a, Jiying Qiu^a, Qingxin Zhou^a, Jinyu Yang^a,*, Leilei Chen^a,*

^a Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of Novel Food Resources Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan 250100, China

^b College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

^c School of Life Science, Central South University, Changsha 410013, China

*Corresponding authors.

E-mail address: yangjinyu86@163.com

chenleilei8210@163.com

Abstract

To study the cell proliferation and wound healing activity of polysaccharides from Ganoderma amboinense (GAMPS), the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation method, and its monosaccharide composition and molecular weight were analyzed. The effects of different concentrations of GAMPS on the cell proliferation were determined by cell survival rate test, and the wound healing ability of GAMPS to NIH/3T3 cells was detected. The preliminary evaluation of the antioxidant ability of GAMPS was conducted by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC). The results showed that the GAMPS was composed of glucose, mannose, and galactose at a molar ratio of 67.62:14.07:7.50, and the weight-average molecular weights were 5.439 × 10⁶ and 1.704 × 10⁵ g/mol by using high-performance gel-permeation chromatography-multiple angle laser scatter (HPGPC-MALS) analysis. GAMPS (0.2 μg/μL) showed the strongest proliferation ability to THP-1 cells, with cell survival rate of 178.7%. The wound healing effect of GAMPS (0.1 μg/μL) was obvious on NIH/3T3 and 3.75 μg/μL of GAMPS showed the strongest total antioxidant ability. All the results indicate that GAMPS promotes cell proliferation, and has cell wound healing effect and strong antioxidant activity. The results provide theoretical foundation for the development and utilization of GAMPS.

Reference:

ZHAO S Z, LEI M, XU H, et al. The normal cell proliferation and wound healing effect of polysaccharides from Ganoderma amboinense[J]. Food Science and Human Wellness, 2021, 10(4): 508-513. DOI:10.1016/j.fshw.2021.04.013.

（來源：食品科學(xué)與人類健康）